一.實驗目的

用差速離心法分離動、植物細胞線粒體。

二.實驗原理

　　線粒體（mitochondria）是真核細胞*的，司能量轉換的重要細胞器。細胞中的能源物質——脂肪、糖、部分氨基酸在此進行zui終的氧化，并通過藕聯磷酸化生成ATP，供給細胞生理活動之需。對線粒體結構與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的。
　　制備線粒體采用組織勻漿懸液介質中進行差速離心的方法。在一給定的離心場中（對于所使用的離心機，就是選用一定的轉速），球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質的粘度。在一均勻懸浮介質中離心一定時間內，組織勻漿中的各種細胞器及其它內含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器中zui先沉淀的是細胞核，其次是線粒體，其它更輕的細胞器和大分子可依次在分離。
　　懸浮介質通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結構和酶的活性，在pH7.2的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個操作過程應注意使樣品保持4℃，避免酶失活。
　　線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠B（Janus green B）是對線粒體專一的活細胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體的細胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態呈現藍綠色從而使線粒體顯色，而細胞質中的染料被還原成無色。

三.大鼠肝線粒體的分離

實驗用品

（一）、材料
　　大鼠肝臟

（二）、試劑
1．生理鹽水。
2．1％詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。
3．0．25mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris—鹽酸緩沖液（pH7．4）：
　　0．1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris） 10ml
　　0．1 mol/L鹽酸 8．4ml
　　加重蒸水到 100ml
　　加蔗糖到0.25 mol/L。蔗糖為密度梯度離心用D（+）蔗糖
4．0．34mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris—鹽酸緩沖液（pH7．4）
5．固定液：甲醇—冰醋酸（9：1）
6．姬姆薩染液：Giemsa粉0．5g，甘油33ml，純甲醇33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研缽內研磨至無顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56℃左右保溫2h令其充分溶解，zui后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。用時吸出少量用1/15mol/L磷酸鹽緩沖液作10～20倍稀釋。
　　1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6．8）：
　　1/15 mol/L KH2PO4 50ml
　　1/15 mol/L Na2HPO4 50ml

（三）、器材
高速離心機、解剖刀剪、小燒杯、冰浴、漏斗、尼龍織物、玻璃勻漿器。

實驗方法

1．制備大鼠肝細胞勻漿。實驗前大鼠空腹12h，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織2g，剪碎，用預冷到0～4℃的0．25mol/L緩沖蔗糖溶液洗滌數次。然后在0～4℃條件下，按每克肝加9ml冷的0．25mol/L緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應分數次添加，勻漿用雙層尼龍織物過濾備用。注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間，整個分離過程不宜過長，以保持組分生理活性。

2．差速離心。先將9ml 0．34mol/L緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心地加入9ml肝勻漿使其覆蓋于上層。用冷凍控溫高速離心機進行差速離心（見圖）。

3．分離物鑒定。
（1） 細胞核；取細胞核沉淀一滴涂片，用甲醇—冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆薩染液（原液10～20倍稀釋）染色10min。自來水沖洗，吹干，鏡檢。結果：細胞核紫紅色，上面附著的少量胞質為淺藍色碎片。

（2） 線粒體；取線粒體沉淀涂片（注意勿太濃密），不待干即滴加1％詹納斯綠B染液染20min，覆上蓋玻片，鏡檢。線粒體藍綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。

實驗注意事項

　　如果使用不帶冷凍控溫的普通高速離心機操作，應盡量縮短操作時間、注意樣品的冷凍，保持其生理活性。

作業與思考題

作 業
　　將線粒體沉淀作一涂片，用姬姆薩染色，檢查是否混雜細胞核和胞質碎片，估計分離所得線粒體的純度。根據你的實際體會，寫出操作注意事項及改進方法。

思 考 題
1．分離介質0．25mol/L及0．34mol/L緩沖蔗糖溶液哪一種在下層?有什么作用?
2．分離出的線粒體立即用詹納斯綠B染色和放置室溫2h后再染色，比較二者著色的差異。

四.玉米線粒體的分離

實驗用品

（一）、材料
玉米黃化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）。

（二）、試劑
1．分離介質；
　　0.25 mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris—鹽酸緩沖液（pH7．4），3 mmo/L EDTA，0．75mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。
50mmol/L的Tris—Hcl緩沖液（pH7．4）配法：
　　 50ml 0．1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與42ml 0．1 mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml。
2．保存液：0．3mol/L甘露醇（pH7．4）
3．20％次氯酸鈉（NaClO）溶液。
4．1％詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。

（三）、器材
溫箱、冰箱、紗布、瓷研缽、冷凍控溫高速離心機。

實驗方法

　　從植物細胞分離線粒體，除了作線粒體功能測定外，在植物細胞遺傳工程中，常用于分離核外基因—線粒體DNA等目的。
　　分離線粒體的方法仍采用均勻介質中的差速離心。介質中0．25 mol/L蔗糖也可以用 0．3mol/L甘露醇代替。EDTA整合二價陽離子，Ca2＋除去后細胞間粘著解體，促使組織分散成單個細胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在細胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用。

1．玉米種子用20％次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒，清水沖洗30min，再浸泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內，保持濕度，置溫箱28℃于暗處培肓2～3d。待芽長到1～2cm長時剪下約15g，放0～4℃1h。
2．加3倍體積分離介質，在瓷研缽內快速研磨成勻漿。
3，用多層紗布過濾，濾液經700×g離心10min。除去核和雜質沉淀。
4，取上清液10 000×g離心10min，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。
5．沉淀為線粒體，可存于0．3mol/L甘露醇中。注意以上勻漿化及離心均控制在0～4℃進行。

實驗結果

　　線粒體的觀察：取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上，不待干立即滴加1％詹納斯綠B染色20min，放上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍綠色圓形顆粒。