細胞活性測定方法 細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素摻入法、 MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan 為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復(fù)性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很 多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹： 1.MTT法
MTT：化學(xué)名： 3-（4，5- 二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的 甲 ，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。 缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲 產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲 的有機溶劑對 實驗者也有損害。 2.XTT法
XTT：化學(xué)名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲 產(chǎn)物。當XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯(lián)合應(yīng)用時，其所產(chǎn)生的水溶性的甲 產(chǎn)物的吸光度與活細胞的數(shù)量成正比。
優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。
缺點：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。 3.CCK-8法或稱WST-8法CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物 （Formazan）。生成的甲 物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。 優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于 MTT；5、對 細胞毒性小；6、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。 缺點:1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多 加。 三種方法的比較 | | MTT法 | XTT法 | CCK-8法（WST-8法） | | 甲臜物水溶性 | 難溶性 | 水溶性 | 水溶性 | | 檢測波長 | 490 nm | 450nm | 450nm | | 性狀 | 粉末 | 2瓶溶液 | 1瓶溶液 | | 使用方法 | 配成溶液后使用 | 現(xiàn)配現(xiàn)用 | 毋需預(yù)制 | | 使用有機溶劑 | DMSO或其它溶劑 | — | — | | 方便性 | + | ++ | +++ | | 檢測速度 | + | ++ | +++ | | 重復(fù)性 | + | ++ | ++ | | 穩(wěn)定性 | ++ | + | ++ | | 工作量 | --- | -- | - | | 對細胞毒性 | --- | -- | - | | 對人體毒性 | --- | - | - | MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項 MTT原理 MTT全稱為3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。 MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。
缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。 MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞數(shù)。在用酶標儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT吸光度在0-0.7范圍內(nèi)。 MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用了。 MTT有致癌性，用的時候小心，有條件帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉。 配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl 8g ＋ KCl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4，定容1L。 普通MTT法實驗步驟：
1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。
2：培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間）。
3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。
4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。 藥物MTT法實驗步驟
貼壁細胞：
1：收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調(diào)密度 1000- 10000 孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
2：5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個復(fù)孔。建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況
3：5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4：每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
5：終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
6：每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7：同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。 懸浮細胞：
1：收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋（儲存液100mg/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100ml 1640） 2：置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3：每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值） 4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。 5、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。 注意事項：
（1） 選擇適當?shù)眉毎臃N濃度。
（2） 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
（3） 設(shè)空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，zui后比色以空白調(diào)零。 （4） MTT實驗吸光度zui后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系。 （5） 用96孔板培養(yǎng)細胞做MTT測細胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定。 （6） 一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲臜洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。 |
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