蘆薈凝膠殼聚糖三元膜對大鼠深Ⅱ度燒傷的治療作用
黃慶芳1，劉冰2*，馮承恩1
1.廣東藥學院醫藥化工學院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥學院藥科學院，廣東 廣州 510006

摘要：目的 制備蘆薈凝膠的膠原-殼聚糖-硫酸軟骨素三元膜，研究其在大鼠皮膚深Ⅱ度燒傷創面愈合過程中的作用。方法 制備蘆薈凝膠的膠原-殼聚糖-硫酸軟骨素三元膜。取大鼠60只，隨機分為模型對照組、濕潤燒傷膏組、三元膜組，每組20只。造成深Ⅱ度燒傷模型后，測量大鼠燒傷后皮膚創面平均愈合時間及第1、3、7、14天創面愈合率，檢測燒傷后第1、14天皮膚創面組織中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量、血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）含量并作統計學分析。結果 與模型對照組相比，三元膜組能縮短燒傷大鼠皮膚創面愈合的時間（P<0.05），提高第3、7、14天的創面愈合率（P<0.01）。燒傷后第14天，與模型對照組相比，三元膜組皮膚創面組織中SOD含量升高（P<0.01），MDA含量降低（P<0.01），血清中TNF-α含量降低（P<0.01）。以上指標，三元膜組和燒傷膏組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 蘆薈凝膠的膠原-殼聚糖-硫酸軟骨素三元膜可通過清除氧自由基、減少促炎癥因子的生成，從而促進大鼠皮膚深Ⅱ度燒傷的愈合。
關鍵詞：膠原-殼聚糖-硫酸軟骨素三元膜；深Ⅱ度燒傷；氧自由基；促炎癥因子
中圖分類號：R644 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9727(2016)07-0629-04 
皮膚是人體大的器官，具有重要的物理、化學、生物學屏障功能，燒傷或創傷后引起的局部或全身損害都與皮膚屏障的喪失有關，早期結痂、封閉修復缺損皮膚、恢復其屏障功能成為燒傷治療的根本目標。國內外不少研究者在研究能促進燒傷皮膚愈合的創面敷料，希望會獲得高效、無刺激性的敷料。目前比較常見的敷料有膠原、殼聚糖、硫酸軟骨素等，這些敷料各有其優缺點。本實驗把以上材料經戊二醛-碳化二亞胺-N-羥基琥珀酰亞胺復合改性，利用分子結構綜合在一起，取長補短，并加入蘆薈凝膠，以觀察蘆薈凝膠的膠原-殼聚糖-硫酸軟骨素三元膜在皮膚深Ⅱ度燒傷創面愈合過程中的作用。
1 材料與方法
1.1 藥物與試劑 殼聚糖（批號：F20110519），硫酸軟骨素（CS，批號：DOO521201），-羥基琥珀酰亞胺（NHS，批號：Ky201105），1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，批號：ALD27234），2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES，批號：HOO270801），甘氨酸(批號：yk201012)，均購自廣州市齊云生物技術有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(批號：20140917)，微量丙二醛測試盒（批號：20140925）購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α 酶聯免疫檢測試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司，批號：20140925）；濕潤燒傷膏（汕頭市美寶制藥有限公司，批號：130724）；庫拉索蘆薈凝膠（廣東藥學院醫藥化工學院提供，批號：20140716）。
1.2 儀器 紫外分光光度計（U-3900型，HITACHI）；1/10萬天平（CP224D型，賽多利斯有限公司）；計算機圖像分析儀（AST 486/PFG Image broad）；冷凍干燥儀（LGJ-10C型，天津四環電氣控制設備有限公司）。
1.3 動物 SD 大鼠，60 只，雌雄兼用，SPF 級，體重180~220 g，由廣東藥學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2012-0125，飼養于屏障環境，飼養溫度20~26 ℃，濕度40%~70%，喂顆粒標準飼料，自由進食和飲水，適應性喂養1周后開始實驗。
1.4 實驗方法
1.4.1 蘆薈凝膠的膠原-殼聚糖-硫酸軟骨素三元膜的制備 膠原按文獻[1]提取，與殼聚糖按1:1比例混合溶解于 0.5 mol/L 的冰醋酸，置于圓形模具中，加入0.25%戊二醛反應24 h，-20 ℃以下預凍4 h，于冷凍干燥儀內凍干成膜。將膠原膜依次置于 50 mmol/LMES、33 mmol/L EDC、25 mmol/L NHS 和含 1% CS 的40%乙醇溶液中浸泡。后將復合支架依次在0.1 mol/L Na2HPO4、1~2 mol/L NaCl、5~50 mmol/L甘氨酸、雙蒸水反復清洗至中性，凍干成膜。每片膜上均勻噴涂0.5 mL蘆薈凝膠，凍干得蘆薈凝膠的膠原-殼聚糖-硫酸軟骨素三元膜，每片3 g，冷藏備用。
1.4.2 大鼠分組及皮膚深Ⅱ度燒傷模型建立 SD大鼠60只，雌雄兼用，隨機分為3 組，即模型對照組、燒傷膏組、三元膜組，每組20只。實驗前1 d大鼠背部兩側皮膚剃毛，面積約為5 cm×5 cm。實驗當日腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后固定，背部用自制操作板（中間有1.2 cm×1.2 cm正方形孔），取等重棉花固定于鑷子中，沾上0.4 mL的酒精，點燃后，利用外焰直接燃燒皮膚，每只大鼠受熱時間為5 s，形成深Ⅱ度燒傷創面（經病理組織切片證實深度到達真皮層；外觀又紅又白，有出血的水泡），立即腹腔內注射乳酸鈉林格氏液5 mL一次以抗休克。各組每天給藥1次，模型組涂抹無菌生理鹽水，燒傷膏組和三元膜組給藥后用無菌紗布和膠布加以固定，使藥物和傷口接觸至少4 h，期間大鼠戴自制項圈，防其舔舐傷口，連續給藥14 d[2]。
1.4.3 愈合療效評價 每日換藥時肉眼觀察創面，創面愈合過程中照相記錄創面情況，通過計算機圖像灰度積分系統分析創面愈合程度，同原始創面進行比對，計算愈合率及平均愈合天數。
1.4.4 大鼠創面組織中 SOD 活性、MDA 含量，血清中TNF-α表達水平的測定 大鼠形成深Ⅱ度燒傷模型后于第 1 天給藥前、第 14 天給藥后 4 h 每組取 10只，頸椎脫臼法處死動物，小心取創面組織塊，用冰冷生理鹽水漂洗除去皮下脂肪和其他結締組織，冰浴條件下制成10%的組織勻漿，1 500 ×g離心15 min，取上清液。嚴格按照試劑盒說明書方法進行檢測。組織中蛋白含量用考馬斯亮藍法，SOD活性用黃嘌呤氧化酶法，MDA用硫代巴比妥酸法，血清中TNF-α表達水平用ELISA法檢測。
1.5 統計學分析 運用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，檢測所得數據以x±s表示，各組間用單因素方差分析比較，P<0.05 為差異有統計意義。
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