木瓜蛋白酶對兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜病變的誘導作用
張 林，張 兵，李 博，康 晉
西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 骨外科，陜西 西安 710038

摘 要：目的 探討木瓜蛋白酶誘導兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的滑膜病理變化。方法 納入 30 只新西蘭大白兔，隨機分為對照和模型組，模型組動物均采用木瓜蛋白酶注射方式制備膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，術(shù)后 2、4、6 周，分別取兩組各 5 只動物，處死后獲得滑膜組織標本，觀察一般情況，對兩組不同時間的滑膜進行 Mankin 評分；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察病理變化；酶聯(lián)免疫法檢測滑膜血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和白細胞介素-1β（IL-1β）表達水平。結(jié)果 木瓜蛋白酶單次注射后第 2 周，對模型組動物進行病理觀察，可見膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)嚴重的滑膜炎性反應，滑膜細胞與下層疏松纖維及血管組織均明顯增生，并存在大量淋巴漿細胞浸潤；隨著時間推移，炎性反應逐漸減輕。隨著注射時間的延長，模型組 Mankin 評分、VEGF和 IL-1β 表達水平均呈下降趨勢，對照組無明顯變化；模型組木瓜蛋白酶注射后 2、4 周的 Mankin 評分、VEGF 和 IL-1β 表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05），注射后 6 周的 Mankin 評分、VEGF 和 IL-1β 表達水平與對照組化比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 木瓜蛋白酶可以誘導兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，木瓜蛋白酶單次注射后第 2 周，兔膝關(guān)節(jié)滑膜炎性反應嚴重，第4、6 周時炎性反應逐漸減輕。
關(guān)鍵詞：膝關(guān)節(jié)；骨關(guān)節(jié)炎；木瓜蛋白酶；動物模型；滑膜；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）；白細胞介素-1β（IL-1β）

中圖分類號：R965.1

文獻標志碼：A

文章編號：1674 - 6376(2018)01 - 0078 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.1674-6376.2018.01.013
骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退行性變以及繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要特征[1]。以往對骨關(guān)節(jié)炎的研究大多集中在關(guān)節(jié)軟骨以及軟骨細胞和軟骨下骨等方面[2-4]，但越來越多的資料表明，關(guān)節(jié)周圍的滑膜與疾病之間存在十分密切的關(guān)系。木瓜蛋白酶注射方式誘導膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是常用的模型制備方法，具有操作簡單等優(yōu)點[5]，但關(guān)于其誘導膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型對滑膜病理作用的相關(guān)問題，報道較少。本實驗利用新西蘭大白兔，采用木瓜蛋白酶注射方式制備膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，通過對注射后不同時間動物滑膜進行 Mankin 評分和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和白細胞介素-1β（IL-1β）表達水平檢測，探討木瓜蛋白酶誘導膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型兔滑膜病的作用機制。
1 材料
1.1 實驗動物
30 只新西蘭大白兔，雌性，體質(zhì)量約 2 kg，健康狀況良好，均由山東省農(nóng)科院提供，動物許可證號SCXK（魯）2010-0025。本次研究相關(guān)方案均提交本院醫(yī)學倫理部門審核，并經(jīng)批準，符合相關(guān)倫理學要求。
1.2 藥物及主要試劑
木瓜蛋白酶，批號 Z26149871，規(guī)格 500 mL，上海子起生物科技有限公司；乙醇，北京綠源大德生物科技有限公司；磷酸緩沖（PBS）液，上海心語生物科技有限公司；VEGF 酶聯(lián)免疫試劑盒，上海恒遠生化科技有限公司；IL-1β 酶聯(lián)免疫試劑盒，北京綠源大德生物科技有限公司；中性甲醛，上海瑤韻生物科技有限公司；鹽酸乙醇，上海研盟生命科學發(fā)展有限公司；勻漿器，北京明陽科華生物科技有限公司；光學顯微鏡，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。
2 方法
2.1 動物分組及膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型[6-8]的制備30 只動物隨機分為 2 組：對照組、模型組，每組 15 只。模型組動物均采用木瓜蛋白酶注射制備膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，選擇兔左膝關(guān)節(jié)進行常規(guī)備皮和乙醇消毒，屈曲 45°，利用注射器進行 4%木瓜蛋白酶水溶液注射。進針點為髕骨下極髕腱外緣，注射中向髁間窩方向進針，達到股骨髁后回撤 2 mm，注射溶液 0.1 mL。術(shù)后觀察動物注射側(cè)情況，如果出現(xiàn)明顯的腫脹，存在屈伸功能障礙，則視為建模成功。經(jīng)觀察，本次模型組 15 只動物均建模成功。對照組不予以特殊處理，術(shù)后對兩組動物置于相同的環(huán)境下喂養(yǎng)。
2.2 術(shù)后標本獲取[9]
木瓜蛋白酶注射后第 2、4、6 周，各組分別取5 只動物，麻醉后處死。即刻切取髕下脂肪墊處滑膜組織約 0.3 mm。利用 PBS 液對組織標本進行洗滌，平均分為兩份，一份用于滑膜組織病理觀察與Mankin 評分，另一份用于酶聯(lián)免疫法檢測 VEGF和 IL-1β 水平。
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